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第三章细胞生物学研究方法

发布时间:2020-02-08 20:29 作者:和记娱乐

  第三章细胞生物学研究方法_生物学_自然科学_专业资料。第三章 细胞生物学研究方法 进行初步观察 形成可验证的假说 查阅已 有知识 设计对照试验 收集资料 解释结果 生物学研究模式生物 不同物种享有共同分子机制 作出合理结论 如何学习细胞生物

  第三章 细胞生物学研究方法 进行初步观察 形成可验证的假说 查阅已 有知识 设计对照试验 收集资料 解释结果 生物学研究模式生物 不同物种享有共同分子机制 作出合理结论 如何学习细胞生物学? ? 抽象思维与动态观点 ? 结构与功能统一的观点 ? 同一性(unity)和多样性(diversity)的问题 ? 细胞生物学的主要内容: 结构与功能(动态特征); 细胞的生命活动 ; ? 实验科学与实验技术——细胞真知源于实验室 ——What we know//How we know. 第三章 细胞生物学研究方法 ?细胞形态结构的观察方法 ?细胞组分的分析方法 ?细胞培养、细胞工程与显微操作技术 第一节 细胞形态结构的观察方法 ?光学显微镜技术(light microscopy) ?电子显微镜技术 (Electro microscopy) ?扫描探针显微镜(Scanning Probe Microscope) 扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope ) 第二节 细胞组分的分析方法 ?离心分离技术 ?细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法 ?特异蛋白抗原的定位与定性 ?细胞内特异核酸的定位与定性 ?放射自显影技术 ?定量细胞化学分析技术 第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术 ?细胞的培养 ?细胞工程 一、光学显微镜技术(light microscopy) ?普通复式光学显微镜技术 ?荧光显微镜技术(Fluorescence Microscopy) ?激光共焦扫描显微镜技术(Laser Confocal Microscopy) ?相差显微镜(phase-contrast microscope) ?微分干涉显微镜 (differential interference contrast microscope, DIC) ?录像增差显微镜技术(video-enhance microscopy) 二、 电子显微镜技术 ?电子显微镜的基本知识 ?电镜与光镜的比较 ?电镜与光镜光路图比较 ?电子显微镜的基本构造 ?主要电镜制样技术 ?负染色技术 ?冰冻蚀刻技术 ?超薄切片技术 ?电镜三维重构技术 ?扫描电镜(Scanning electron microscope,SEM) SPM(Scanning probe microscope) 三、 扫描遂道显微镜 ?Scanning Probe Microscope,SPM (80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器) 包括:STM、AFM、磁力显微镜、摩擦力显微镜等 原理:扫描探针与样品接触或达到很近距离时,即产生彼此间相互作用力,如 量子力学中的隧道效应(隧道电流)、原子间作用力、磁力、摩擦力等, 并在计算机显示出来,从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。 ?装置:扫描的压电陶瓷,逼近装置,电子学反馈控制系统和数据采集、处理、显示 系统。 ?特点:(1)可对晶体或非晶体成像,无需复杂计算,且分辨本领高。 (侧分辨率为0.1~0.2nm,纵分辨率可达0.01nm); (2)可实时得到样品表面三维图象,可测量厚度信息; (3)可在真空、大气、液体等多种条件下工作;非破坏性测量。 (4)可连续成像,进行动态观察 ?用途:纳米生物学研究领域中的重要工具,在原子水平上揭示样本表面的结构。 普通复式光学显微镜技术 光镜样本制作 分辨率是指区分开两个质点间的最小距离 荧光显微镜技术(Fluorescence Microscopy) ?原理与应用 ?直接荧光标记技术 ?间接免疫荧光标记技术 ?在光镜水平用于特异蛋白质 等生物大分子的定性定位: 如绿色荧光蛋白(GFP)的应用 激光共焦扫描显微镜技术 (Laser Scanning Confocal Microscopy) ?原理 ?应用: 排除焦平面以外光的干扰,增强 图像反差和提高分辨率(1.4—1.7), 可重构样品的三维结构。 ?相差显微镜(phase-contrast microscope) 将光程差或相位差转换成振幅差,可用于观察活细胞 ?微分干涉显微镜(differential-interference microscope) 偏振光经合成后,使样品中厚度上的微小区别转化成 明暗区别,增加了样品反差且具有立体感。适于研究 活细胞中较大的细胞器 ?录像增差显微镜技术(video-enhance microscopy) 计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率下研究活 细胞中的颗粒及细胞器的运动 电镜与光镜的比较 显微镜 分辨本领 光源 透镜 线nm 可见光 玻璃透镜 不要求真空 利用样品对光的吸收形 (400-700) 成明暗反差和颜色变化 100nm 紫外光 玻璃透镜 不要求线nm 电子束 电磁透镜 (0.01-0.9) 要求线Pa 利用样品对电子的散射 和透射形成明暗反差 电镜与光镜光路图比较 电子显微镜的基本构造 主要电镜制样技术 ? 超薄切片技术 用于电镜观察的样本制备示意图 ?负染色技术(Negative staining)与金属投影 染色背景,衬托出样品的精细结构 ?冰冻蚀刻技术(Freeze etching) (技术示意图) 冰冻断裂与蚀刻复型:主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒 和膜表面结构。 快速冷冻深度蚀刻技术(quick freeze deep etching) ?电镜三维重构技术 电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的 具有重要应用前景的一门新技术。 电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振 分析技术相结合,是当前结构生物学(Structural Biology) ——主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。 扫描电镜 ?原理与应用: ?电子“探针”扫描,激发样品表面放出二次电子, 探测器收集二次电子成象。 ? CO 2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张 力问题 一、 离心分离技术 ?用途:于分离细胞器与生物大分子及其复合物 ?差速离心:分离密度不同的细胞组分 ?密度梯度离心:精细组分或生物大分子的分离 二、 细胞内核酸、蛋白质、 酶、糖与脂类等的显示方法 ?原理:利用一些显色剂与所检测物质中一些 特殊基团特异性结合的特征,通过显 色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来 判断某种物质在细胞中的分布和含量。 Feulgen Staining 三、特异蛋白抗原的定位与定性 ?免疫荧光技术: 快速、灵敏、有特异性,但其分辨率有限 (图) ?蛋白电泳(SDS-PAGE) 与免疫印迹反应(Western-Blot) ?免疫电镜技术: ?免疫铁蛋白技术 ?免疫酶标技术 ?免疫胶体金技术 应用:通过对分泌蛋白的定位,可以确定某种蛋白的分 泌动态;胞内酶的研究;膜蛋白的定位与骨架蛋白的 定位等 四、细胞内特异核酸的定位与定性 ?光镜水平的原位杂交技术 (同位素标记或荧光素标记的探针) ?电镜水平的原位杂交技术 (生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合) ?PCR技术 五、放射自显影技术 ?原理及应用: ?利用同位素的放射自显影,对细胞内生物大分子进行 定性、定位与半定量研究; ?实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。 ?步骤: ?前体物掺入细胞(标记:持续标记和脉冲标记) ———放射自显影 六.定量细胞化学分析技术 ? 细胞显微分光光度术(Microspectrophotometry) ?利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收,测定这些物质 (如核酸与蛋白质等)在细胞内的含量。 包括: 紫外光显微分光光度测定法 可见光显微分光光度测定法 ? 流式细胞仪(Flow Cytometry) ?主要应用: 用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量; 测定细胞群体中不同时相细胞的数量; 从细胞群体中分离某些特异染色的细胞; 分离DNA含量不同的中期染色体。 一、细胞的培养 ?动物细胞培养 ? 类型:原代培养细胞(primary culture cell) 继代培养细胞(sub-culture cell) ? 细胞株(cell strain) 正常二倍体,接触抑制 ? 细胞系(cell line) 亚二倍体,接触抑制丧失 ?植物细胞 ?类型: 原生质体培养 (体细胞培养) 单倍体细胞培养(花药培养) ? 非细胞体系(cell-free system) 二、细胞工程 ?细胞融合(cell fusion)与细胞杂交(cell hybridization)技术 ?单克隆抗体(monoclone antibody)技术 图 ?细胞拆合与显微操作技术 ?物理法结合显微操作技术(图1、图2) ?化学法结合离心技术 ?制备核体(karyoplast)和胞质体(cytoplast)。 ?其它技术 遗传分析(mutant, knock out, knock in) 对细胞生命活动的研究成为当今生命科学发展的瓶颈 对细胞生命活动的研究成为当今生命科学发展的瓶颈 细胞生命活动 突突变变体体分分析析 蛋白修饰分析 基因表达 序列测定 DNA分离与克隆 功能基因组学 生物信息学 机器人技术 (robotics) 多肽定性分析 双向电泳分析 蛋白质分离与制备 蛋白质组学 A comparison of yeast cells that were growing on the vaginal epithelium seen with different types of LM. a)under bright-field; b)phase-contrast; c)DIC Examples of negtively stained and metal-shadowed specimens. Electron micrographs of a tobacco rattle virus after negtive staining with potassium phosphotungstate(a) or shadow casting with chromium(b). Drosophila melanogaster Caenorhabditis elegans Arabidopsis thaliana Hela细胞(左)、CHO细胞(右)的培养

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